6 Aug

牛津仪器EDS和OmniProbe辅助冷冻FIB制备冷冻STEM样品

传统的聚焦离子束(FIB)技术是在室温条件下从特定部位提取TEM样品。在FIB中安装冷台后,可对整个冷冻样品进行减薄和结构成像,在抛磨过程中样品要保持在反玻璃化温度以下。近些年,冷冻纳米操纵手和冷台的发展使冷冻FIB提取技术成为现实。

对于生物样品,以往一般采用关联方法定位感兴趣区域,如分子荧光标记(FLM)。但FLM图像的分辨率比较低,给准确定位带来很大难度。理想情况下,在FIB中直接找到感兴趣区域,然后进行切取要简单的多。

双束FIB/SEM本身可以产生多种反映亚表层结构信息的信号,如BSD信号和元素的X射线信号。根据Kanaya-Okayama公式估算,30keV的电子束在水中的最大深度d约为24μm,BSE信号的出射深度大约为d/3,Fe Kα射线在水中的出射深度约为0.73d,是BSE信号深度的两倍,因此X射线信号可以探测更深的信息。

康奈尔大学的Zachman等以含有氧化铁颗粒的硅凝胶为例,验证EDS配合冷冻FIB原位提取样品的可行性。样品是一种硅凝胶,凝胶内部含有微米级氧化铁颗粒。

图1 EDS引导FIB原位切取感兴趣区域的过程

在冷冻FIB提取样品过程中,采用牛津仪器的X-Max 80探头定位凝胶中的氧化铁颗粒。在低倍下,元素面分布图(图1d)可以提供亚表层结构内的元素分布信息。用X-Max 80找到单个颗粒,通过SE成像判断颗粒是在样品表面还是表面以下。之后,用元素分布图引导FIB切取,这样可以保证最后的样品中含有感兴趣区域(图1c, f)。X-Max 80和FIB结合有效提高了样品制备的成功率。

图2 冷台、纳米操纵手OmniProbe 200上的冷冻针尖和定制的样品转移台

冷冻FIB提取样品时用到冷台、冷冻纳米操纵手以及特制的样品载物台。在牛津仪器纳米操纵手OmniProbe 200上安装有冷冻针尖,在提取过程中可以让样品始终保持在反玻璃温度以下,结构如图2b所示。一个陶瓷部件将冷冻尖端与未冷却部位隔离开,连接在抗污染器上的铜带为针尖提供制冷,针尖冷却15min后,温度即可降到反玻璃化温度以下并保持稳定,冷却速率与系统其他组件基本同步。

图3 冷冻FIB提取、抛磨TEM样品的过程

冷冻FIB提取样品的过程与传统FIB制样方法基本一致。在样品提取时,用OmniProbe 200的冷冻针尖趋近薄片,用水蒸气将尖端与样品粘结。之后,将薄片转移到TEM样品网上。再用FIB将含有固-液界面的薄片减薄到100nm以下。

图4 硅凝胶中微米级氧化铁颗粒的HAADF图像及X-Max 80获得的元素分布图

如图4所示,在制取微米级氧化铁颗粒时,硬结构本身可以对一侧的界面起到保护作用。位于硬颗粒上部的软材料会被离子束破坏,但氧化铁颗粒对下面的凝胶材料会起到保护作用,从而保留了软-硬界面。X-Max 80获得的结果可轻易区分界面上主要元素Fe、O、Si的分布。

结语

Zachman等尝试将冷冻STEM与冷冻FIB结合起来,在FIB提取样品前使用X-Max 80对亚表层结构进行定位,根据元素分布引导FIB切取感兴趣区域。然后使用带有冷冻针尖的纳米操纵手OmniProbe 200提取样品,这种方法可大大地提高冷冻样品制取的成功率,拓展冷冻FIB的应用范围。之后进行冷冻STEM分析,可以获取固-液界面的结构、元素和化学键信息。

本文原作者

Michael J. Zachman

Emily Asenath-Smith

Lara A. Estroff

Lena F. Kourkoutis

文章来源

Microscopy and Microanalysis 22, 1338-1349,2016

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